不同冷變形量高氮不銹鋼生物相容性研究

 利用大鼠骨髓基質(zhì)干細胞比較不同冷變形量高氮不銹鋼的生物相容性差異。選取拉伸率分別為0、14%、34%、64%的高氮不銹鋼分別設為A、B、C、D組，通過細胞粘附性實驗、MTT檢測及堿性磷酸酶活性分析比較其生物相容性的不同。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著冷變形量的不斷增加，其生物相容性也在不斷地提高，表面細胞的堿性磷酸酶活性及吸光度逐漸增大，細胞生長狀態(tài)良好。結(jié)論高氮不銹鋼的生物相容性隨著冷變形量的增加而增加。

  修復由外傷、腫瘤、畸形修復等導致的骨組織缺損是臨床工作中面臨的巨大問題。常規(guī)修復分為自體移植修復和生物材料替代等，自體移植由于自體組織有限，移植操作難度大，手術費用高，且增加新的創(chuàng)傷，患者精神、經(jīng)濟負擔較大。隨著材料學發(fā)展，生物材料替代是近年來興起的一種修復方法。生物材料替代是利用金屬或非金屬材料替代缺失組織，這類材料需要有較高的生物相容性，以鈦、鈦合金較為常見。但鈦、鈦合金等價格高昂，加工不易，所以研發(fā)一種價格便宜、容易加工的材料是材料學的研究方向。傳統(tǒng)的不銹鋼合金含鎳，易致畸、致敏。研制一種機械性能良好且不含鎳的不銹鋼極為重要。無鎳不銹鋼用氮和鎂替代鎳，即高氮鋼，其擁有良好的抗腐蝕性、機械性能及生物相容性。隨著氮含量的增加，高氮鋼的生物相容性增加。材料的親水性對細胞在其表面粘附和生長起到關鍵作用。材料內(nèi)的氮元素含量影響材料的親水特性。隨著氮含量增加，高氮鋼的生物相容性增加。冷變形的拉伸可改變材料表面親水性。骨髓基質(zhì)干細胞廣泛存在于機體內(nèi)，由于最早于骨髓中得到分離，常被稱為骨髓基質(zhì)干細胞。本研究利用大鼠骨髓基質(zhì)干細胞探討不同冷變形量的高氮不銹鋼的生物相容性差異。

一、材料與方法

  實驗材料為中國科學院金屬研究所提供的不同冷變形量的高氮不銹鋼，拉伸率分別為0、14%、34%、64%，分別設為A、B、C、D組。經(jīng)高溫固溶、切片、拋光，制作成10mm×10mm×1mm的薄片，清洗消毒后備用。

二、研究方法

1.骨髓基質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)擴增

   將4周齡的大鼠(雌雄不限)脫頸處死后，無菌分離雙側(cè)股骨，去除軟組織，剪斷骨端，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10ml沖洗骨髓腔。收集沖洗后液體，置于培養(yǎng)瓶中，2天后首次換液，連續(xù)培養(yǎng)時，每隔4天換液，每7天傳代。培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗;培養(yǎng)條件37℃，濕度100%，5%CO2。傳代比例為1∶6。連續(xù)擴增細胞備用。

2.高氮不銹鋼表面細胞培養(yǎng)及成骨誘導

  將預先消毒處理好的不同冷變形比例的高氮不銹鋼片放入24孔板，每種冷變形比例的高氮鋼片設3個復孔，將細胞懸液的濃度調(diào)整為1×104個/ml，以模仿人體的成骨微環(huán)境。在每個材料表面及空白孔內(nèi)滴加1 ml細胞懸液。培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+雙抗。培養(yǎng)條件:37℃，濕度100%，5%CO2。連續(xù)培養(yǎng)。

3.細胞粘附

  將骨髓基質(zhì)干細胞接種于不同冷變形比例的高氮鋼片表面，12小時后輕輕去掉培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)。將粘附細胞量除以種植細胞量以獲得細胞在不同金屬片表面的粘附率。

4.MTT實驗

  稱取0.5g MTT，溶于100ml的磷酸緩沖鹽溶液中，針頭濾器過濾除菌，置于4℃避光保存。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。通過MTT實驗對不同冷變形高氮鋼表面粘附細胞活性進行檢測，由于一部分粘附于金屬材料表面的細胞已死亡，為精確確定金屬表面活細胞的數(shù)目和細胞活力而進行MTT細胞活性檢測。將在金屬表面培養(yǎng)的第1、3、5 天的細胞按試劑盒的方法進行MTT檢測。

5.觀察材料表面細胞形態(tài)

  在金屬片接種細胞的第1、3、5天分別按組取出金屬片，PBS沖洗，2.5%戊二醛固定，50%、75%、95%、100%乙醇梯度脫水，金相顯微鏡觀察細胞數(shù)量和形態(tài)。

6.堿性磷酸酶檢測實驗

  分別將種植于材料表面的細胞培養(yǎng)至第1、3、5天，取出用PBS輕輕沖洗3遍，在4℃環(huán)境下用0.01%TritonX-100裂解細胞12小時，然后用吸管反復吹打1分鐘，使細胞充分碎解。按照試劑盒的說明進行檢測，堿性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏單位表示，結(jié)果以3次獨立實驗的平均值表示。

二、材料表面細胞粘附率及細胞形態(tài)

  A、B、C、D組高氮不銹鋼表面細胞粘附率分別為88%、90%、93%、94%。隨著冷變形率的提升，材料表面粘附的細胞數(shù)量提升，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。將基質(zhì)干細胞種植于材料表面培養(yǎng)1、3、5天后，在金相顯微鏡下觀察細胞增殖情況及細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞在材料表面生長良好并發(fā)生增殖。比較第1天各組金屬表面的細胞光密度值，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。第3、5天，隨不同冷變形率高氮鋼與細胞接觸作用時間的延長，吸光度逐漸增大，細胞生長狀態(tài)良好，各種冷變形率的高氮鋼均對基質(zhì)干細胞沒有破壞和抑制生長作用，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。第1天，4種金屬表面的細胞堿性磷酸酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在第3、5天時，隨著冷變形率的增高，高氮鋼表面的細胞堿性磷酸酶活性增高，組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

  各種原因引起的骨缺損是臨床常見的癥狀，由于骨缺損而引起的軟組織塌陷和相關功能障礙是臨床中的常見問題。生物醫(yī)用金屬材料由于高硬度的力學性能及耐腐蝕性被廣泛應用，以鈦、鈦合金及醫(yī)用奧氏體不銹鋼較為常見。奧氏體不銹鋼含有鎳，鎳原子對細胞的直接損害及長期致畸作用已被證實。性能良好且不含鎳的生物醫(yī)用金屬材料對骨缺損患者極為重要。生物醫(yī)用金屬材料植入骨組織的過程中，不可避免的會造成骨組織損傷。早期機械性固位時，骨髓基質(zhì)干細胞在骨修復開始時會從組織中游出，并向損傷處聚集，在各種生物因子的作用下，產(chǎn)生成骨性分化，首先分化為成骨前體細胞，最終變?yōu)楣羌毎９腔|(zhì)將植入材料和骨組織結(jié)合，最終完成生物性固位。在此過程中，處于正常骨組織和植入材料之間的基質(zhì)干細胞的數(shù)量、活性、增殖性及成骨分化能力對于植入材料的后期穩(wěn)定性和生物相容性起著重要作用。本研究中，基質(zhì)干細胞作為檢測不同冷變形量的高氮不銹鋼的生物相容性的種子細胞，將其接種于不同冷變形量的高氮不銹鋼表面12小時后發(fā)現(xiàn)，隨著冷變形量的增加，其細胞粘附率同時增加，這可能于冷變形量增大提高材料表面的親水性有關。作為生物材料此結(jié)果意味著在材料植入機體后，初期冷變形量大的高氮鋼周圍可以聚集更多的基質(zhì)干細胞。MTT檢測法可有效區(qū)分細胞群中的活性細胞。實驗結(jié)果證明，隨著冷變形量的增加，高氮鋼表面的細胞活性隨之增加。堿性磷酸酶活性可檢測基質(zhì)干細胞在材料表面的成骨能力，其結(jié)論為隨著冷變形量的增加，高氮不銹鋼表面的細胞堿性磷酸酶活性隨之增加。同時，通過金相顯微鏡直觀觀察整個細胞培養(yǎng)過程中高冷變形量的高氮鋼表面的細胞密度更高。綜上所述，隨著冷變形率的提高，高氮鋼的生物相容性提高。但加工冷變形會對高氮不銹鋼的力學性能產(chǎn)生影響，而植入材料不僅要具有良好的生物相容性，還需具有良好的機械性，今后仍需進一步研究。